近日，九游会老哥俱乐部、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室陈守文教授团队最新研究成果“Engineered Multiple Translation Initiation Sites: A Novel Tool to Enhance Protein Production in Bacillus licheniformis and Other Industrially Relevant Bacteria”（人工多翻译起始位点：适用于地衣芽胞杆菌及其它工业菌株的新型高效蛋白表达工具），发表于国际权威期刊 Nucleic Acids Research (IF 19.160)。硕士研究生张曼玉和宋静为该论文共同第一作者，王勤副教授和陈守文教授为共同通讯作者，湖北大学为第一单位。

枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌以及谷氨酸棒杆菌等革兰氏阳性菌，具有独特且多样的代谢产物，强大的胞外蛋白合成能力，高细胞密度和高生产力，以及生物安全性等优点，它们作为新兴的合成生物学底盘细胞在食品以及医疗等领域受到特别青睐。然而，高强度和标准化表达元件工具箱的缺乏是这些菌株释放巨大潜力并被广泛应用的主要障碍之一。该研究在目的基因的mRNA前导区构建了包含多拷贝核糖体绑定位点 (RBS) 的全新表达工具（PRBS），能够在革兰氏阳性菌地衣芽胞杆菌中使目的基因由多个位点进行翻译起始，从而使其蛋白表达量随翻译起始位点的增加而梯度上升 (图1)，当含有六个RBS时，绿色荧光蛋白的表达量达到了胞内蛋白的50%以上（目前已报道的最高水平）。

图1. 地衣芽胞杆菌中蛋白表达水平随mRNA前导区RBS序列拷贝数的增加而增加。a. 绿色荧光蛋白的mRNA前导区含有起始密码子的RBS序列的串联，其中茎环上的绿色部分为SD序列，蓝色方框为起始密码子；b. 多拷贝RBS序列（RRBS）对于mRNA翻译起始和延伸影响的模型猜想c.胞内绿色荧光强度随RBS序列拷贝数的增加而增加；d. 纯化后绿色荧光蛋白的条带数与其前导区的RBS拷贝数相对应，证实了存在多翻译起始位点。

可靠、标准化表达元件的缺乏是非模式工业菌株急需解决的一个难题。不同编码基因会形成不同的二级结构是影响RBS表达强度一致性的重要因素，而本研究构建的新型表达元件PRBS可以消除不同二级结构对翻译效率的影响。为了验证PRBS的鲁棒性和实用性，团队成员在地衣芽胞杆菌中表达不同的胞外和胞内工业酶（图2），结果表明对于不同的蛋白，PRBS均呈现表达量随翻译起始位点的增加而梯度上升的趋势，因此PRBS提供了一系列标准化表达元件能够对不同蛋白实现稳定输出。同时，为了验证新型表达元件PRBS的普适性，研究人员在其它工业菌株中探究了PRBS对蛋白表达的影响。结果表明在革兰氏阳性菌枯草芽胞杆菌和谷氨酸棒杆菌中，蛋白表达和地衣芽胞杆菌呈现相似的趋势，证实了PRBS在不同菌株中的通用性。综上所述，该研究构建了一种具有高效性、鲁棒性和普适性的全新基因表达元件，适用于一系列革兰氏阳性工业菌株。

图2. 地衣芽胞杆菌中多拷贝RBS（PRBS）对于胞内外蛋白表达的影响。a. 对角蛋白酶胞外表达量和酶活的影响；b. 对精氨酸酶胞外表达量和酶活的影响；c. 多拷贝RBS（PRBS）用于羟基酪醇的全细胞催化，在表达胞内蛋白时，由于目的蛋白具有多翻译起始位点，其前端多余的氨基酸序列可能会影响胞内蛋白的折叠，从而降低酶活，因此我们在地衣芽胞杆菌的基因组上整合了TEV蛋白酶，并在多拷贝RBS和编码基因间加入TEVP酶切位点。结果表明，加入TEV酶切位点后，羟基酪醇的转化率随RBS拷贝数的增加而增加

据悉，本文通讯作者王勤副教授主要从事合成生物学和生物材料的研究，在Nucleic Acids Res、Adv Funct Mater、ACS Syn Biol等国际知名专业期刊发表论文20余篇。陈守文教授团队长期从事芽胞杆菌生物技术科研和产业化开发，获得科技部重点研发计划、“973”计划、“863”计划、国家支撑计划、国家科技攻关、国家自然科学基金、教育部新世纪人才支持计划、湖北省科技重大专项等多项国家和省部级课题支持。在地衣芽胞杆菌的系统生物学、代谢组学、代谢工程、蛋白表达、发酵工程等领域取得了系列研究成果，聚γ-谷氨酸、杆菌肽、酶制剂、天然芳香族产物以及农用微生物菌剂等产品发酵生产技术在我国多家企业推广应用。

论文链接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac1039/6830669